筛库技术和点对点验证

在生物学领域中通常指的是通过高通量的方法筛选大量生物分子（如DNA、RNA、蛋白质等）以寻找具有特定功能或与已知分子相互作用的成员。在酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）系统中的筛库技术，主要用于大规模筛选蛋白质-蛋白质相互作用。点对点验证则是在筛库发现潜在的相互作用蛋白后，通过酵母单杂交或双杂交技术进一步验证这些蛋白与诱饵蛋白之间的直接相互作用。

技术原理

酵母转录因子GAL4包括两个结构域，即DNA结合结构域（DNA-binding domain, BD）和转录激活结构域（Activating domain, AD）。BD能够识别位于GAL4效应基因（GAL4-responsive gene）的上游激活序列（Upstream activating sequence, UAS）并与之结合，AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD分别单独作用并不能激活转录，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，转录启动子下游基因并使其表达。

在酵母双杂交系统中，BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，AD与BD会在空间上充分接近，重新构成结构域，启动报告基因的转录。拥有BD质粒的酵母可以在某一缺陷培养基上生长，拥有AD质粒的酵母菌可以在另一种缺陷培养基上生长，通过接合（mating）或共转化使酵母同时拥有AD与BD质粒。如果BD上的目的蛋白与AD上的猎物蛋白存在相互作用，这样的酵母可以在三缺及四缺的培养基上生长，并启动β-半乳糖苷酶基因。

酵母双杂交系统由三个部分组成：

1.与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）。

2.与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）。

3.带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。

双杂交筛库的实验思路是以启动子或研究蛋白为诱饵，筛选酵母双杂交文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，最终确定与启动子或研究蛋白相互作用的蛋白。

应用场景

1.高灵敏度地检测蛋白-蛋白的交互作用；

2.寻找在蛋白-蛋白交互作用中起关键作用的结构域或活性位点；

3.寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白；

4.寻找具有药物治疗作用的小分子多肽；

5.寻找调控蛋白质相互作用的化合物；

6.绘制蛋白质相互作用图谱。

技术要点

1.构建诱饵质粒；

2.构建猎物文库；

3.转化和筛选；

4.表型检测；

5.阳性克隆鉴定。

服务流程

酵母双杂筛库

1.载体构建

2.诱饵自激活验证

感受态细胞制备

转化感受态细胞

自激活观察

3.文库筛选

AH109感受态制备

转化感受态细胞

AH109（pGKT7-Bait）感受态制备

转化AH109（pGKT7-Bait)感受态细胞

点板验证后进行PCR测序

点对点验证

1.载体构建

2.诱饵自激活验证

感受态细胞制备

转化感受态细胞

自激活观察

3.互作验证

感受态细胞制备

共转酵母感受细胞

产品优势

一站式辅助检测方便快捷，结论可靠；

实验结果可靠，图片美观；

同时研究多个蛋白质相互作用，实现高通量筛选和分析，获得信息；

采用多重筛选步骤，减少非特异性相互作用的误报。

代表结果展示

(Chen et al., 2018, Plant,Cell & Environ)