Western blot—研究中分离和鉴定蛋白质的技术

免疫印迹，又被称为蛋白质印迹（Western blot, WB），是一种复合性的免疫学检测技术。该方法通过利用 SDS-PAGE 技术，在生物样本中将蛋白质分子根据其分子量在凝胶上进行分离，随后通过电转移的方式将这些蛋白质转移到固相膜上。固相膜上的蛋白质充当抗原，与相应的抗体发生免疫反应，接着与酶标记的第二抗体发生反应。最终，通过底物显色或荧光成像等手段，检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白质。该技术被广泛应用于研究基因在蛋白质水平的表达、检测抗体活性以及早期诊断疾病等多个领域。与 Southern 或 Northern 杂交方法类似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。

蛋白免疫印迹实验的检测步骤所采用的方法有所不同。一个常见的区别涉及直接与间接检测。直接检测方法使用酶或荧光基团直标的一抗检测印迹上的目标抗原。这种检测方法并未广泛使用，因为出于多种原因，大多数研究人员更偏好间接检测方法。间接检测方法首先使用未标记的一抗与抗原相结合。随后，使用酶标二抗或荧光标记二抗来检测一抗。标记物（或偶联分子）可能包含生物素、荧光探针（比如 Invitrogen Alexa Flour 或 DyLight 荧光基团）和酶偶联物（比如辣根过氧化物酶 HRP 或碱性磷酸酶 AP ）。与直接检测方法相比，间接检测方法具有很多优势。如下图。

技术原理

蛋白质免疫印迹法，即 Western Blot ，基本原理涉及通过 PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）对蛋白质样品进行分离，随后将其转移至固相载体，如硝酸纤维素薄膜（NC 膜）或 PVDF 膜。固相载体以非共价键方式吸附蛋白质，同时能够保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性的不变性。

在该过程中，固相载体上的蛋白质或多肽被作为抗原，与相应的抗体发生免疫反应，随后与酶或同位素标记的第二抗体发生反应。最终，通过底物显色或放射自显影等手段，实现对电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分的检测。

这一方法的关键在于其能够通过将蛋白质固定在固相载体上并与特异性抗体相互作用，从而实现对目标蛋白的高灵敏度和高特异性检测。这种分析手段在研究蛋白质表达和功能、抗体诊断以及生物医学研究中发挥着重要的作用。

实际应用

1、检测材料或药物对某个信号通路上蛋白靶点的影响：肝癌是最常见的原发性癌症之一，仍是全球第六大癌症相关死亡原因。上海理工大学李钰皓副教授研究团队用铋基介孔纳米材料( NBOF )负载 SOR ，然后用聚乙二醇和叶酸偶联物( P-FA )包覆，形成了 NBOF@SOR-P-FA 纳米载体体系。该系统通过将化疗和放射治疗相结合，实现了显著增强的抗癌效果；

2、研究基因在蛋白水平的表达有机磷阻燃剂( OPFR )的大量使用；

3、疾病早期诊断。

技术要点

1、试剂准备；

2、蛋白样品制备；

3、蛋白含量的测定；

4、SDS - PAGE 电泳；

5、转膜；

6、免疫反应；

7、化学发光，显影，定影；

8、凝胶图象分析。

服务流程

需要您提供需检测的样品，其要求如下：

1、离体后迅速超低温处理并 -80 ℃冻存的组织样品，干冰运输；  组织：动物组织应不少于100 mg，植物组织不少于500 mg；

2、细胞：大于5×10⁶个细胞；

3、细胞或组织裂解液总蛋白浓度须大于1 mg/mL，单个样品不少于50 μl。

产品优势

1、完善的一站式服务体系，提供 WB 保证型抗体定制服务；

2、在样品处理、转印和抗体稀释比例上有着独到理解；

3、微信查询订单进度，实验最新进展一手掌握。

代表性成果

(Chantarawong et al., 2019, Nutr Cancer)

(Howard et al., 2022, Sci Rep)