Pull-down assay

下拉实验（Pull-down assay）是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外实验技术，近年来越来越受到广大研究者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”（目的蛋白），洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行，操作方便。

技术原理

pull down体外（蛋白-蛋白）技术是体外条件下研究蛋白质相互作用的方法。先将体外表达的GST融合蛋白结合到谷胱甘肽Beads上，再将靶蛋白-GST-Beads和细胞裂解液孵育，这样互作蛋白便一起吸附在Beads上。洗涤掉未结合的蛋白后，再用洗脱液将互作蛋白复合物从Beads洗脱下来，即GST pull down产物。这种互作复合物既可以用Western Blot检测已知蛋白，也可用质谱鉴定出未知蛋白。

应用场景

1. 可用于验证两种已知蛋白可能存在的直接互作关系（GST pull-down+Western blot）；

2.寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知蛋白（GST pull-down+LC-MS）；

3.了解蛋白质之间的相互作用，揭示蛋白质网络的拓扑结构和功能模块，为研究生物过程提供基础知识和新的治疗靶点；

4.研究蛋白质互作网络中的关键节点和功能模块。筛选和鉴定与目标蛋白特异性结合的互作蛋白，从而揭示蛋白质相互作用的动态调控机制；

5.研究蛋白质复合物的组成和结构，以及信号传导通路的调控。

技术要点

1.靶蛋白制备；

2.构建诱饵复合体；

3.细胞裂解液准备；

4.孵育与捕获；

5.洗脱与检测。

服务流程

GST pull-down MS

1.提取蛋白

原核表达蛋白纯化

真核蛋白提取（以烟草为例，蛋白X来源）

2.体系孵育与pull-down

3.SDS-PAGE验证

4.质谱分析

GST pull-down

1.原核表达蛋白纯化

2.体系孵育与pull-down

3.考染检测与WB验证

4.GST pull-down结果分析

产品优势

1.多年服务经验，服务客户众多；

2.对蛋白互作的筛选鉴定理解深刻，擅长针对客户具体情况提出合适的方案建议；

3.自有分子及细胞生物实验平台，能有效制定并执行最优的实验路线；

4.自有蛋白质组学平台，对微量CoIP实验产物的质谱鉴定有十足的把控能力，对后续的生物信息分析有独到的见解。

代表结果展示

(Chen et al., 2018, Cancer Research)