IP 和 Co-IP

IP（免疫沉淀，Immunoprecipitation）是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再用 Protein A/G 抗体-目的蛋白复合物从混合液中沉淀下来，最后将靶蛋白从磁珠上洗脱，并通过 SDS-PAGE ，Western Blot 等手段对洗脱下来的蛋白进行分析。主要用于抗原或者抗体的定性检测。

Co-IP（免疫共沉淀，Co-inmunoprecipitation）是经典的利用抗体从样品中捕获靶蛋白及其互作蛋白、复合体的一项技术，能够特异性富集所研究的目的蛋白。由于过程中采用了非变性条件，保留了互作及复合体的细胞内状态。相对于酵母双杂交、Pull down 等方法，其特色之一便是捕获的蛋白互作发生在所研究的特定组织细胞内，保存了互作蛋白及复合体的“内源”状态。

IP 的作用是富集和检测某单一蛋白。Co-IP 的作用是检测 2 个蛋白是否在体内有相互作用，但是不能确定是直接或间接相互作用。蛋白间相互作用是细胞各种基本功能的主要完成者，参与几乎所有的重要生命活动。因此，蛋白-蛋白相互作用研究以及建立相互作用的关系网络图，具有十分重要的意义，也是目前蛋白质研究领域的热点。

技术原理

IP：可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物（免疫复合物），据此免疫复合物设计沉淀实验。一般是利用 Protein A -磁珠或 Protein G -磁珠将该免疫复合物从混合物中沉淀下来，最后将可溶性靶蛋白从磁珠上洗脱下来（如果抗体没有共价连接到磁珠上或使用变性缓冲液进行洗脱，抗体也会被洗脱下来）。

Co-IP：以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X 的抗体免疫沉淀X ，那么与 X 在体内结合的蛋白质Y 也能沉淀下来。

应用场景

      1、IP

（1）已广泛应用于基因、蛋白质以及它们之间相互作用等领域的研究，并且其可与多种技术联合应用，也可合并一些实验方法进行多方面探索。

（2）与基因组技术、放射同位素技术、聚合酶链式反应、免疫印迹等实验方法相结合，对较复杂的蛋白质与 DNA \ RNA 的关系和定位提供非常好的解决方法。其主要分为染色质免疫沉淀技术、蛋白质免疫沉淀技术和放射免疫沉淀技术等。

      2、Co-IP：

（1）揭示蛋白质复合物的组成和功能：Co-IP 技术可以用于鉴定蛋白质复合物的组成和结构。通过选择特定的目标蛋白质作为抗体的靶点，可以将其与其他相互作用蛋白质共沉淀，从而确定蛋白质复合物的组成。这有助于理解蛋白质复合物在细胞内的功能、相互作用网络和信号传导通路。

（2）研究信号传导和基因调控：Co-IP 技术可用于研究蛋白质在信号传导和基因调控中的相互作用。例如，可以通过共沉淀实验来确定转录因子与 DNA 序列的结合，并揭示基因调控的机制。此外，Co-IP 还可用于研究蛋白质激酶和底物之间的相互作用，从而了解细胞信号传导通路的调控机制。

（3）鉴定疾病相关的蛋白质复合物：Co-IP 技术可用于鉴定与疾病相关的蛋白质复合物。通过将目标蛋白质与疾病相关的样本共沉淀，可以发现与疾病发生和发展相关的蛋白质相互作用。这有助于理解疾病的发病机制、寻找潜在的治疗靶点，并为药物开发和治疗策略提供重要的线索。

（4）蛋白质交互作用网络分析：通过大规模的 Co-IP 实验和蛋白质组学技术结合，可以构建蛋白质交互作用网络图谱。这些网络图谱提供了蛋白质相互作用网络的全貌，有助于了解细胞内蛋白质相互作用网络的结构和功能。这对于研究细胞过程、生物学调控和疾病机制等具有重要的意义。

技术要点

      1、IP

（1）收获细胞，加入适量细胞 IP 裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者 4 ℃裂解 30 min, 12000 r离心 30 min后取上清；

（2）取少量裂解液以备 Western blot 分析，剩余裂解液将 1 μg相应的抗体和 10-50 μl protein A/G-beads 加入到细胞裂解液，4 °C缓慢摇晃孵育过夜；

（3）免疫沉淀反应后，在4 °C 以 3000 r速度离心 5 min，将 protein A/G-beads 离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads 用1 ml裂解缓冲液洗 3-4 次；最后加入15 μl的2× SDS 加样缓冲液，沸水煮10 min；

（4）SDS-PAGE,  Western blotting或进行质谱分析。

  2、Co-IP

（1）样品制备：样本经过适当的刺激等处理之后，经过预冷的 PBS 清洗，根据目的蛋白的类型加入适合的细胞裂解液，收集细胞裂解液；

（2）加入抗体孵育过夜：加入抗体前，留一部分裂解液作为阳性对照，剩余裂解液加入相应的抗体，在 4 ℃条件下缓慢摇晃孵育过夜；

（3）免疫共沉淀：加入 proteinA/G 到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中，4 ℃条件下缓慢摇晃，孵育过夜；

（4）微珠清洗：免疫沉淀反应后离心收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物用裂解缓冲液冲洗三次，以游离抗原、抗体和珠子；

（5）WB 分析：离心，将上清电泳分析。

服务流程

  需要您提供：

1、离体后迅速超低温处理并 -80 ℃冻存的组织样品，干冰运输；

2、组织：动物组织不少于400 mg；植物组织不少于2 g；

3、细胞：2 ×10⁷个细胞。

产品优势

  1、直接检测蛋白质与其他分子（如蛋白质、DNA 或 RNA）之间的相互作用，提供了定性和定量信息；

      2、可以在原生条件下进行，更接近细胞内环境，有助于揭示生物体内的相互作用；

      3、可以研究复杂的蛋白质复合物，包括多个亚基或较大的蛋白质复合物；

      4、可以通过验证和功能研究进一步验证相互作用的生物学功能。

代表性成果

(Wang et al., 2019, Eur J Med Chem)

(Li et al., 2019, Antiviral Res)