EMSA和双荧光素酶报告基因分析

1.研究背景：

质膜H+-ATPase在植物维持离子平衡、特别是排出多余的Na+以应对盐胁迫中发挥关键作用。PeWRKY1被认为通过结合到PeHA1的启动子区域，调控其表达，从而增强植物的抗盐能力。作者研究了胡杨（Populuseuphratica）中的PeWRKY1转录因子在盐胁迫中的作用，特别是它如何通过调控质膜H+-ATPase基因PeHA1的表达来增强植物的耐盐性。

2.研究方法：

(1)基因表达分析：通过定量PCR分析了胡杨在盐胁迫条件下PeWRKY1和PeHA1的表达模式。

(2)DNA亲和纯化测序（DAP-seq）：用于鉴定PeWRKY1的基因组结合位点，确定其直接靶基因。

(3)酵母单杂交（Y1H）和电泳迁移率变动分析（EMSA）：用于验证PeWRKY1是否直接与PeHA1启动子的W-box结合。

(4)双荧光素酶报告基因分析（LRA）：用于确认PeWRKY1能否激活PeHA1的表达。

(5)转基因实验：通过在烟草中过表达PeWRKY1，分析其对植物耐盐性的影响。

3.研究结果：

(1)盐胁迫诱导PeHA1和PeWRKY1的表达：在200mMNaCl处理后，胡杨的PeHA1和PeWRKY1基因在根和叶中均表现出显著上调，表明它们在盐胁迫响应中起重要作用。

(2)PeWRKY1与PeHA1启动子的结合：通过DAP-seq分析，发现PeWRKY1能够结合到PeHA1启动子的W-box区域。Y1H和EMSA实验进一步验证了这一结合的存在，确认了PeWRKY1通过直接结合W-box调控PeHA1的表达。

(3)PeWRKY1激活PeHA1的表达：LRA实验显示，当PeWRKY1和PeHA1启动子同时在烟草叶片中表达时，PeHA1的启动子活性显著增强，表明PeWRKY1可以激活PeHA1的表达。

(4)PeWRKY1增强植物的盐耐性：在过表达PeWRKY1的转基因烟草植株中，研究者观察到这些植物在盐胁迫下表现出更强的H+-ATPase活性和Na+排出能力，因而表现出更高的耐盐性。这些转基因植株的MDA含量较低，表明其细胞膜受到的氧化损伤较少。

4.研究结论：

PeWRKY1通过直接调控质膜H+-ATPase基因PeHA1的表达，增强了胡杨在盐胁迫下的耐盐性。PeWRKY1通过结合PeHA1启动子的W-box激活其表达，促进了质膜H+-ATPase的活性，从而增强了Na+的排出和植物的耐盐能力。

在这篇文章中，电泳迁移率变动分析（EMSA）和双荧光素酶报告基因分析（LRA）被用来验证PeWRKY1与PeHA1启动子之间的直接相互作用及其对PeHA1基因表达的调控作用。

以下是这两种技术在文章中的详细应用过程：

电泳迁移率变动分析（EMSA）

目标：EMSA用于验证PeWRKY1是否能够直接与PeHA1基因启动子区域的W-box结合。W-box是WRKY转录因子的典型结合位点。

方法：

1.探针制备：

研究者首先从PeHA1启动子区域中设计了含有W-box序列的寡核苷酸探针，并通过生物素标记（Biotin-labeled）对探针进行了标记，以便在后续的检测中使用。

2.蛋白质表达与纯化：

PeWRKY1蛋白的编码序列被克隆到表达载体中，并在大肠杆菌中表达出重组PeWRKY1蛋白。通过亲和纯化方法（如Ni-NTA柱）获得纯化的PeWRKY1蛋白。

3.结合反应：

在EMS反应体系中，将生物素标记的W-box探针与纯化的PeWRKY1蛋白混合孵育，以检测二者是否结合。为验证结合的特异性，设置了竞争实验（使用未标记的W-box探针）和突变实验（使用突变的W-box探针）。

4.电泳与转膜检测：

(1)反应混合物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（NativePAGE）进行分离，随后通过干式转膜将DNA-蛋白复合物转移到尼龙膜上。

(2)使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）检测系统检测生物素标记的探针位置，从而确定是否形成了DNA-蛋白复合物。

结果：

EMSA结果显示，PeWRKY1蛋白能够特异性地结合到PeHA1启动子中的W-box区域。当使用竞争性未标记探针或突变探针时，结合信号显著减弱或消失，进一步证明了这种相互作用的特异性。

双荧光素酶报告基因分析（LRA）

目标：LRA用于验证PeWRKY1是否能够激活PeHA1基因的表达，检测PeWRKY1转录因子对PeHA1启动子活性的调控作用。

方法：

1.载体构建：

报告载体：将PeHA1基因启动子区域克隆到pGreenII0800-LUC载体中，报告基因系统包含荧光素酶（LUC）基因，启动子活性可以通过LUC基因的表达水平来测量。

效应载体：PeWRKY1的编码序列被克隆到35S启动子驱动的表达载体中，以便在植物细胞中高效表达PeWRKY1蛋白。

2.农杆菌介导的瞬时表达：

通过农杆菌介导的方法，将报告载体和效应载体共同转入烟草（Nicotianabenthamiana）叶片中，建立瞬时表达系统。

3.荧光素酶活性检测：

(1)在转基因烟草叶片中表达一段时间后（通常是2-3天），使用荧光素酶底物对LUC活性进行检测。

(2)使用比色法或荧光计数器测量LUC和内参基因（通常为Renillaluciferase,REN）的相对荧光强度，计算LUC/REN比值，以评估PeWRKY1对PeHA1启动子活性的影响。

结果：

LRA结果表明，当PeWRKY1蛋白在烟草叶片中共同表达时，PeHA1启动子的LUC活性显著增强。这表明PeWRKY1能够激活PeHA1启动子的表达，从而增加了PeHA1基因的转录水平。

EMSA确认了PeWRKY1能够直接结合到PeHA1启动子中的W-box区域，证明了这种结合在调控PeHA1基因表达中的特异性。

LRA实验进一步验证了PeWRKY1通过激活PeHA1启动子，增强了PeHA1基因的表达。这两项实验共同揭示了PeWRKY1在胡杨盐胁迫响应中的调控机制。