酵母杂交

1.研究背景：

植物通过模式识别受体（PRRs）触发的模式触发免疫（PTI）和效应子触发免疫（ETI）共同作用，来抵抗病原体的侵染。WRKY转录因子是调控植物免疫反应的关键元件，但其在多年生木本植物（如杨树）中的具体作用机制仍不清楚。作者探讨PagWRKY18在杨树抗病反应中的作用机制，特别是其如何通过调控多种下游基因来触发免疫反应并维持细胞内活性氧（ROS）稳态。

2.研究方法：

(1)RNA-seq和DAP-seq：作者首先通过RNA-seq分析了杨树在受到病原菌侵染后的转录组变化，随后利用DNA亲和纯化测序（DAP-seq）鉴定了PagWRKY18的结合位点，解析其调控的基因网络。

(2)基因功能验证：构建了PagWRKY18的过表达杨树转基因株系，通过酵母单杂交（Y1H）、双荧光素酶报告基因（LUC）实验和电泳迁移率变动分析（EMSA）验证PagWRKY18与目标基因的相互作用。

(3)生化实验：通过DAB染色法和H2O2测定等实验分析了ROS的产生与清除情况。

3.研究结果：

(1)杨树在病原菌侵染后的转录组重编程：

通过RNA-seq分析，作者发现杨树在病原菌侵染后启动了广泛的转录组重编程，激活了多个与抗病相关的基因。PagWRKY18在这一过程中表现出显著的上调，表明其在病原菌应答中的重要作用。

(1)PagWRKY18与目标基因的结合及其调控功能：

利用DAP-seq，作者鉴定了PagWRKY18在杨树基因组中的大量结合位点，并发现其主要富集在启动子区域。PagWRKY18通过直接结合这些启动子区域，调控了多种与抗病和ROS稳态相关的基因，如PagSOBIR1和PagGSTU7。

(2)PagWRKY18过表达增强了杨树的抗病性：

在过表达PagWRKY18的杨树转基因株系中，作者观察到这些植物在病原菌侵染后的病斑面积显著减小，且ROS积累水平较低，抗病能力显著增强。

(3)PagWRKY18调控ROS稳态和植物免疫：

作者通过Y1H、LUC和EMSA实验验证了PagWRKY18可以直接结合并激活PagGSTU7和PagSOBIR1的表达。这些基因参与了ROS清除和免疫信号的传导，进一步支持PagWRKY18在维持ROS稳态和增强植物免疫中的关键作用。

(4)负反馈机制的发现：

研究还发现PagWRKY18与PagPR4之间存在负反馈调控机制，PagWRKY18不仅激活PagPR4的表达，还通过这种相互作用调控自身活性，防止过度的免疫反应。

4.研究结论：

这项研究揭示了PagWRKY18在杨树病原体应答中的关键调控作用，特别是其通过调控ROS相关基因维持细胞内稳态和触发植物免疫反应的机制。PagWRKY18通过与多种目标基因的相互作用，协调了植物生长与免疫反应之间的平衡，为进一步理解多年生木本植物的抗病机制提供了新见解。

在这篇文章中，酵母单杂交（YeastOne-Hybrid,Y1H）和酵母双杂交（YeastTwo-Hybrid,Y2H）技术被用于研究PagWRKY18与其下游基因及其潜在相互作用蛋白之间的相互作用。

以下是这两种技术在文章中的详细应用过程：

酵母单杂交（Y1H）技术的应用

1.目标：

酵母单杂交技术用于验证PagWRKY18转录因子是否直接与特定基因的启动子区域结合。这些基因包括PagSOBIR1、PagGSTU7和PagPR4，它们在植物免疫反应中发挥关键作用。

2.方法：

构建诱饵载体：研究者首先将PagSOBIR1、PagGSTU7和PagPR4基因的启动子片段克隆到pAbAi载体中，作为诱饵（Bait）。

构建猎物载体：同时，PagWRKY18基因的全长cDNA被克隆到pGADT7载体中，作为猎物（Prey）。

酵母转化与筛选：将诱饵载体转化至酵母菌株Y1HGold中，通过抗性筛选获得阳性克隆。随后，将猎物载体转化至含有诱饵载体的酵母菌株中，通过在含有抗生素AureobasidinA（AbA）的选择性培养基上培养，筛选出能够激活报告基因（例如，生长在高浓度AbA培养基上的菌株）。

结果分析：通过PCR验证阳性克隆，并通过不同稀释度（如10^-1、10^-2）的点接种实验，进一步确认PagWRKY18是否能够与这些启动子直接结合。

3.结果：

结果显示，PagWRKY18能够直接与PagSOBIR1、PagGSTU7和PagPR4的启动子区域结合，这表明PagWRKY18在转录调控这些基因中发挥了重要作用。

酵母双杂交（Y2H）技术的应用

1.目标：

酵母双杂交技术用于检测PagWRKY18与其他蛋白质（如PagPR4）之间的直接相互作用。这有助于揭示PagWRKY18在调控植物免疫反应中是否与其他蛋白质协同作用。

2.方法：

构建诱饵载体：PagWRKY18基因的全长cDNA被克隆到pGBKT7载体中，作为诱饵（Bait）。

构建猎物载体：PagPR4基因的全长cDNA被克隆到pGADT7载体中，作为猎物（Prey）。

酵母转化与筛选：将诱饵载体转化至酵母菌株Y2HGold中，并通过抗性筛选获得阳性克隆。随后，将猎物载体转化至含有诱饵载体的酵母菌株中，通过在含有3-氨基-1,2,4-三唑（3AT）的选择性培养基上培养，筛选出能够激活报告基因（如HIS3、ADE2）的酵母克隆。

结果分析：阳性克隆通过PCR和不同选择性培养基上的生长情况验证，确认PagWRKY18与PagPR4蛋白之间的直接相互作用。

3.结果：

Y2H实验结果表明PagWRKY18与PagPR4之间存在直接的蛋白质-蛋白质相互作用。这一发现进一步支持了PagWRKY18通过与PagPR4合作调控植物免疫反应的假设。

酵母单杂交（Y1H）：用于验证PagWRKY18能否与下游目标基因（如PagSOBIR1、PagGSTU7和PagPR4）的启动子区域直接结合。结果证明了PagWRKY18在这些基因的转录调控中起到直接作用。

酵母双杂交（Y2H）：用于检测PagWRKY18与其他蛋白质（如PagPR4）之间的直接相互作用。结果表明PagWRKY18可以与PagPR4直接相互作用，这为理解PagWRKY18在植物免疫反应中的复杂调控机制提供了证据。

通过这两种技术，作者系统性地解析了PagWRKY18在调控杨树免疫反应中的作用，为进一步理解植物抗病机制提供了重要的实验依据。