双荧光素酶测定(蛋白-DNA)

荧光素酶生物检测技术诞生于 1990 年，已有 30 年的发展史。单荧光素酶检测系统到双荧光素酶检测系统的发展，为科研人员提供了更为严谨的实验手段。双荧光素酶报告基因检测系统在原有的基础上引入了海肾报告基因，可以排除不同组之间细胞生长状况、细胞数目以及转染效率带来的干扰，起到校正的作用，从而使实验结果更为可靠。

双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素。其中荧火虫荧光素是从萤火虫中分离得到，分子量为 61 kDa；而海肾（Renilla luciferases）荧光素酶则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为 36 kDa。

二者在以下方面有所区别：①底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP 和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（Coelenterazine）和氧气。②发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长 550-570 nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长 480 nm。正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双荧光素酶报告实验中得到广泛应用

技术原理

将目的基因转录调控原件构建入带有荧光素酶(Firefly luciferase)的表达载体，构建成报告基因质粒，使这段序列调控 luciferase 的转录表达。然后将报告基因质粒转染细胞，给予其不同的处理后裂解细胞，并加入底物荧光素(luciferin)，luciferase 可催化 luciferin 发出荧光(最强波长在 560 nm左右)。检测得到的荧光值高低可以判断不同处理组对该转录调控原件的影响。为避免由于质粒转染细胞时效率差异所造成的误差，通常会转入 Renilla luciferase的报告基因质粒作为内参(最强波长在 465 nm左右)，即双荧光素酶报告系统。

实际应用

1、miRNA 靶基因验证：将预测能够与 miRNA 结合的靶基因 3’ UTR 序列插入载体中萤火虫荧光蛋白（firefly luciferase）的 3’ UTR。当我们感兴趣的 miRNA 和质粒中的插入序列结合后，miRNA 会通过和所插入的序列结合从而抑制萤火虫荧光蛋白的翻译最终造成荧光值的下降。海肾素荧光蛋白（renilla luciferase）作为内参来去除组间的转染效率差异。

2、转录因子调控验证：使用双荧光素酶的发光强度来模拟下游基因的表达，荧光变强说明启动子活力变强，说明实验阳性。

3、ceRNA 研究：ceRNA 作为一种细胞内调控机制在研究中尤其是 lncRNA 机制研究中成为一个热点。细胞内存在竞争性内源 RNA（Competitive endogenous RNA, ceRNA），这些 ceRNA 分子（mRNA、lncRNA、circRNA等） 能够通过 miRNA 应答元件竞争结合相同的 miRNA 以达到调节彼此表达水平。造成的影响就是影响 mRNA 的表达，开启了一扇转录组研究的新大门。

技术要点

1、报告基因质粒的构建。将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上，如 pGL3-basic ；

2、转染细胞。将报告基因质粒和 phRL-TK (内参)共转染细胞，根据需要对细胞进行处理。共转染时，由于内参具有很强的启动子，因此报告基因质粒：内参转染量一般为 10:1~50:1；

3、Luciferase 活性测定：

（1）初次使用时，配制 LAR II，即 Firefly luciferase 的底物。将 LAR II 溶解在 LAR II buffer 中，并分装 -80 ℃避光保存；

（2）加入 1× PLB，室温裂解细胞 15 min；

（3）配制 Stop&Glo，即 Renilla luciferase 的底物，能够终止 LAR II的反应；

（4）测定荧光值。向 40 ul的 LAR II 中加入10 ul细胞裂解液，吹打混匀后，检测读数，即为 Firefly luciferase 的值。加入 40 ul Stop&Glo，再次读数，即为 Renilla luciferase 的值；

（5）数据处理。首先计算出每管的 Firefly luciferase/Renillaluciferase 的比值，再以 control 组的比值为单位 1 ，即可得到不同处理组的相对 luciferase 活性，也就是该处理组基因转录的调控活性。

实验注意事项：

1、为保证荧光素酶检测试剂的稳定性可以采取适当分装后避光保存的方法，以免反复冻融和长时间暴露于室温；

2、为取得最佳检测效果，同一批样品最好保证相同的测定时间，通常为 10 s。

服务流程

需要您提供基因模板，需提供详细的转录因子、目的基因或 microRNA 信息。

产品优势

1、萤光信号强：用于弱启动子或低水平表达调控的检测；

2、检测范围宽：线性范围达 8 个数量级( R²> 0.99)；

3、灵敏度高： 检测灵敏度低至10-18；

4、实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。

典型案例

(Wang et al., 2013, Nat Cell Biol)

(覃玉凤，等, 2017, 农业生物技术学报)