Dap-seq

1.研究背景：

作者探讨了水稻中昼夜节律核心成分CIRCADIANCLOCKASSOCIATED1(OsCCA1)在应对非生物胁迫（如盐胁迫、渗透胁迫和干旱胁迫）中的功能，重点分析了OsCCA1如何通过调控脱落酸（ABA）信号通路来增强水稻的胁迫耐受性。

2.研究方法：

(1)基因编辑：利用CRISPR/Cas9技术生成了OsCCA1的敲除突变体（Oscca1L1和Oscca1L2），并通过实验验证了这些突变体的功能缺失。

(2)胁迫实验：通过对野生型和突变体水稻进行盐胁迫、渗透胁迫和干旱胁迫实验，比较了它们的生长表现和存活率。

(3)DNA亲和纯化测序（DAP- seq）：使用DAP-seq技术在基因组范围内鉴定了OsCCA1的直接靶基因，并分析了其结合位点的特征。

RNA测序（RNA-seq）：对处理过盐胁迫的突变体和野生型水稻进行RNA-seq分析，确定了与OsCCA1相关的差异表达基因。

3.主要结果：

(1)OsCCA1缺失突变体对非生物胁迫敏感：OsCCA1突变体对180mMNaCl、渗透胁迫（如180mM甘露醇）和干旱胁迫表现出显著的敏感性，其存活率显著低于野生型，突变体中的钠离子（Na+）积累和活性氧（ROS）水平也显著增加。

(2)鉴定了OsCCA1的直接靶基因：通过DAP-seq，作者发现OsCCA1的结合位点主要集中在基因启动子区域，确定了5319个结合峰，涵盖了692个OsCCA1直接调控的靶基因。这些靶基因包括参与ABA信号通路的关键基因如OsPP108和OsbZIP46。

(3)发现了OsCCA1的核心结合基序：通过分析DAP-seq数据，作者发现了一个核心结合基序“AAAATATCT”，并将其命名为rCBS（riceCCA1bindingsite）。OsCCA1通过这一基序调控其靶基因的表达。

(4)OsCCA1调控ABA信号通路：RNAseq结果显示，OsCCA1的突变导致多个ABA信号通路相关基因的表达下调，包括8个OsPP2C家族成员和OsbZIP46等。OsCCA1直接结合这些基因的启动子，激活其表达，从而调控ABA信号通路。

(5)OsCCA1对ABA的负调控作用：实验表明，OsCCA1突变体对ABA处理更加敏感，表现为更强的ABA抑制生长效果和较低的存活率，进一步证实了OsCCA1在ABA信号通路中的负调控作用。

4.研究结论：

OsCCA1通过直接调控ABA信号通路中的关键基因（如OsPP108和OsbZIP46），在水稻的生长与非生物胁迫响应之间起到了关键的协调作用。这项研究揭示了OsCCA1在增强水稻耐受多种非生物胁迫中的重要作用。

以下是DAP-seq在文章中的详细技术应用过程：

1.蛋白表达和纯化：

(1)研究者首先将OsCCA1蛋白的编码序列克隆到含有HaloTag标签的表达载体中。随后，在小麦胚芽提取物系统中表达该融合蛋白。

(2)利用MagneHaloTag磁珠纯化并捕获表达的OsCCA1蛋白。

2.基因组DNA的制备和切割：

(1)从21天大的水稻植株叶片中提取基因组DNA，并将其进行超声波处理以生成片段化的DNA。

(2)这些DNA片段随后通过连接接头以适应于后续的测序步骤。

3.DNA亲和纯化：

(1)纯化的OsCCA1HaloTag融合蛋白与片段化的基因组DNA混合。通过OsCCA1蛋白的特异性结合位点，DNA片段与蛋白复合物结合。

(2)使用磁珠将结合了OsCCA1的DNA片段从混合物中分离出来。

4.高通量测序：

(1)对经过亲和纯化的DNA片段进行高通量测序，生成OsCCA1在水稻基因组中的结合位点数据。

(2)为了提高数据的可靠性，实验设置了对照组，即没有OsCCA1蛋白的样品处理流程（作为阴性对照）。

5.数据分析：

(1)使用Bowtie2软件将测序数据比对到水稻参考基因组。

(2)利用MACS2（ModelbasedAnalysisofChIPSeq）软件识别OsCCA1在基因组中的结合峰，并通过IDR（IrreproducibleDiscoveryRate）分析提高峰识别的可靠性。

(3)对识别出的结合峰进行注释，以确定OsCCA1的结合位点主要分布在启动子区域和基因间区域，并且少量位于外显子和内含子区域。

(4)使用MEMESuite软件进行基序分析，识别出在OsCCA1结合区域内显著富集的核心序列“AAAATATCT”，命名为rCBS（riceCCA1bindingsite）。

6.功能富集分析：

对DAP-seq识别出的OsCCA1直接靶基因进行了GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes）通路富集分析，发现这些基因主要参与激素信号转导（如ABA信号）和昼夜节律相关的生物过程。

7.验证实验：

为验证DAP-seq数据的可靠性，研究者进行了电泳迁移率变动分析（EMSA）和染色质免疫沉淀qPCR（ChIP-qPCR）实验。这些实验进一步确认了OsCCA1与其靶基因启动子区域（例如OsPP108和OsbZIP46）之间的直接结合。

通过DAP-seq技术，研究者成功鉴定了OsCCA1在水稻基因组中的直接靶基因，并揭示了其在调控水稻对非生物胁迫响应中的重要作用。这项技术提供了高分辨率的基因组结合位点信息，为理解转录因子如何调控基因表达提供了强有力的工具。